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主營：原位雜交,亞細胞定位,蛋白互作,啟動子篩選
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| 先生： |
為什么有的基因定位結(jié)果與預(yù)想的不一致？
對于一個特定的定位載體，只要熒光表達較好，植物亞細胞定位，其定位結(jié)果是確定的，不會隨人為意愿或操作而改變。至于有時候和預(yù)想的結(jié)果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達載體以及熒光蛋白融合方式等有關(guān)。
為什么有的普通定位結(jié)果出來后無法準確判斷其定位位置？
細胞中的細胞器復(fù)雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細胞器外，有些細胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細胞器，它們的熒光表達形狀可能都是點狀，因此不易區(qū)分。這時可以結(jié)合基因的其他功能研究來判斷其可能表達的位置。另外，蛋白表達本身也是一個復(fù)雜的過程，涉及到多個合成場所及轉(zhuǎn)運過程，自身表達情況可能比較復(fù)雜，因此不易判斷具體的表達位置。
理解復(fù)雜生理過程：細胞內(nèi)的各種生理過程是由不同亞細胞位置的蛋白質(zhì)協(xié)同作用完成的。亞細胞定位研究可以幫助我們更好地理解這些復(fù)雜生理過程的機制。
設(shè)計靶標：許多的作用靶點是特定亞細胞位置的蛋白質(zhì)。準確確定蛋白質(zhì)的亞細胞定位可以為設(shè)計提供有價值的靶標信息。
亞細胞定位的研究方法：
融合報告基因定位法：將待研究的蛋白質(zhì)與報告基因融合，通過觀察報告基因的表達位置來確定蛋白質(zhì)的亞細胞定位。常用的報告基因有綠色熒光蛋白（GFP）等。
免疫組織化學(xué)定位法：利用特異性與蛋白質(zhì)結(jié)合，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的位置。
蛋白質(zhì)組學(xué)定位技術(shù)：通過對細胞內(nèi)不同亞細胞組分的蛋白質(zhì)進行分離和鑒定，確定蛋白質(zhì)的亞細胞定位。
共分離標記酶輔助定位法：利用與特定亞細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的標記酶，通過共分離實驗確定蛋白質(zhì)的亞細胞定位。
生物信息學(xué)預(yù)測：基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列等信息，利用計算機算法預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞定位。
洋蔥亞細胞定位的方法包括但不限于以下三種：
熒光法：利用抗原與的特異性結(jié)合，在細胞內(nèi)產(chǎn)生熒光標記，從而確定細胞內(nèi)抗原的分布位置。
GFP融合蛋白表達法：將目的蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)融合，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達位置。
亞細胞分離法：通過一定的物理或化學(xué)方法，將細胞進行破碎，然后通過離心、密度梯度離心等方法將細胞器分離出來，再對分離出來的各個細胞器進行成分和結(jié)構(gòu)分析。
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