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武漢科銳諾生物科技有限公司
主營：外泌體,透射電鏡,掃描電鏡,石蠟切片等技術(shù)服務
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阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%1甲1醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。
預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。
雜交：傾去預雜交液，滴加含探針has-circ-ST6GALNAC6 probe 雜交液，濃度6ng/ul，恒溫箱37度雜交過夜。
雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。
滴加封閉液：滴加封閉血1清（正常兔血1清），室溫30min。
滴加鼠抗地1高辛標記過氧化物酶（anti-DIG-HRP）：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。
熒光原位雜交技（fish）原理：是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內(nèi)相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細胞器中的定位。
熒光原位雜交技（fish）實驗步驟：
1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。
2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，植物組織原位雜交技術(shù)服務，包埋。
3、切片：石蠟經(jīng)切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-無水乙醇Ⅰ 5min-無水乙醇Ⅱ 5min，風干，DEPC水浸泡。
5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復液中煮沸10分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
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第4年
