在利用液質聯(lián)用技術（LC-MS/MS）分析蛋白質、多肽等生物大分子時，變性（Denaturation）是一個極其關鍵的樣品前處理步驟。其核心目的是破壞生物大分子的高級結構（二、三、四級結構），使其線性展開。這對于后續(xù)的分析至關重要，原因如下：

1.暴露酶切位點：蛋白質通常需要被特定的蛋白酶（如胰蛋白酶）切割成更小的肽段才能被質譜有效分析和鑒定。天然折疊的蛋白質會隱藏其酶切位點，導致酶切效率低下甚至失敗。變性使蛋白質伸展，讓酶切位點充分暴露。

2.提高溶解度：某些蛋白質或復合物在天然狀態(tài)下溶解度差，容易聚集沉淀。變性劑有助于溶解這些難溶性組分。

3.破壞非共價相互作用：變性打斷蛋白質內部的氫鍵、疏水相互作用等，瓦解其緊密結構，為后續(xù)的還原和烷基化步驟創(chuàng)造條件。

4.滅活蛋白酶/酶：高溫或強變性劑能有效滅活樣品中可能存在的內源性蛋白酶，防止它們在后續(xù)處理中降解目標蛋白。

常用的變性條件

生物大分子LC-MS/MS檢測中常用的變性條件主要依賴于化學變性劑和熱變性：

1.強變性劑：

*尿素（Urea）：常用濃度6-8M。通過破壞氫鍵網絡使蛋白質變性。優(yōu)點是價格低廉，使用廣泛。注意：高溫下（>37°C）尿素會分解產生異氰酸酯，導致蛋白質氨基甲?；ㄒ环N非酶修飾），干擾后續(xù)分析，因此通常避免高溫長時間處理。

*鹽酸胍（GuanidineHydrochloride,GuHCl）：常用濃度6-8M。變性能力比尿素更強，能更有效地溶解難溶蛋白和破壞疏水核心。它同樣能抑制蛋白酶活性。相比尿素，在高溫下更穩(wěn)定，不易產生副反應。

*十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，常用濃度0.1%-2%。通過破壞疏水相互作用并包裹蛋白質使其帶負電荷而變性溶解。關鍵點：SDS會嚴重干擾質譜電離和色譜分離，必須在酶切前徹底去除（通常通過沉淀、過濾或強離子交換色譜除鹽柱實現(xiàn)）。

2.還原劑（輔助變性并打斷二硫鍵）：

*二硫蘇糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）：常用濃度5-20mM。這些還原劑能打斷維持蛋白質高級結構的二硫鍵（-S-S-），將其還原為巰基（-SH），是變性不可或缺的搭檔。通常在變性劑存在下加入。

3.熱變性：

*將樣品在含有變性劑/還原劑的緩沖液中加熱（通常90-100°C，5-15分鐘），能更快速、徹底地破壞蛋白質結構，尤其對結構穩(wěn)定的蛋白質有效。使用鹽酸胍時更常結合高溫處理。

典型流程順序：通常先加入變性劑和還原劑（常結合熱變性）使蛋白質完全變性、還原（打斷二硫鍵），然后進行烷基化（常用碘乙酰胺IAA或碘乙酸IAM，濃度10-50mM，室溫避光反應20-30分鐘），將暴露的巰基（-SH）烷基化封閉，防止其重新形成二硫鍵。最后，在酶切前可能需要稀釋或更換緩沖液（特別是使用尿素時，需降低濃度至<2M以下，因為高濃度尿素會抑制胰蛋白酶活性）。

廣州中森檢測的蛋白解離方法

廣州中森檢測作為專業(yè)的第三方檢測機構，其蛋白質組學或靶向蛋白質分析服務中采用的蛋白解離（通常指包含變性、還原、烷基化的完整前處理流程）方法，會嚴格遵循科學規(guī)范和項目需求。雖然具體內部優(yōu)化流程可能不公開，但可以預期他們會采用行業(yè)廣泛接受的標準方法，核心步驟通常包括：

1.裂解：使用含有強變性劑（如8M尿素或6M鹽酸胍）和還原劑（如5-10mMDTT或TCEP）的裂解緩沖液處理樣品（細胞、組織等），充分裂解細胞、溶解蛋白并變性還原。此步驟常結合超聲破碎（助溶）和加熱（如95°C，5-10分鐘）。

2.烷基化：在還原后加入烷基化試劑（如20-50mMIAA），室溫避光反應以封閉巰基。

3.緩沖液置換/稀釋：尤其在使用尿素時，會通過稀釋、超濾或緩沖液置換（例如使用除鹽柱）將溶液環(huán)境調整到適合后續(xù)酶切的條件（如降低尿素濃度至<2M，或換成Tris-HCl等緩沖液，pH~8.0）。

4.酶切：加入胰蛋白酶（或其他蛋白酶），在適宜溫度（通常37°C）下進行過夜酶解，將蛋白質切割成肽段混合物。

總結：變性是LC-MS/MS蛋白質分析成功的基礎。通過合理使用變性劑（尿素/鹽酸胍/SDS）、還原劑（DTT/TCEP）和熱處理的組合，并配合嚴謹?shù)倪€原、烷基化流程，才能確保蛋白質被充分解離、酶切，最終獲得高質量的質譜數(shù)據(jù)用于定性和定量分析。廣州中森檢測等專業(yè)機構會依據(jù)樣品類型和檢測目標，優(yōu)化并執(zhí)行這些關鍵的前處理步驟。